|
摘 要 利用正交试验法优选芳樟树叶总内酯成分的超声提取工艺条件。选择提取次数(A)、提取时间(B)、乙醇浓度(C)和乙醇用量(D)为考察因素,以芳樟总内酯含量为考察指标,选用L9(34) 正交表对这4个因素进行综合研究,得到了超声提取芳樟有效成分的最佳工艺条件为：在室温、超声波的条件下，芳樟树叶粉末6倍量的90 %乙醇提取1次,提取60min。与传统有机溶剂冷浸法和索式提取法相比，超声波法提取具有提取效率高，条件温和等优点。
关键词 芳樟树叶 内酯 超声提取 正交试验法
樟属植物是重要的经济树种，从樟叶中提取的芳香油在香料、医药和化工合成方面都有广泛的用途。樟属植物种类繁多，其精油化学组成不尽相同，厦门牡丹香化公司人工组培的牡丹一号纯种芳樟，其树叶精油芳樟醇含量超过96％，樟脑含量低于0.2％，是优良的香精香料原料树种[1]。在提取芳樟精油的过程中产生大量的叶渣，目前主要做肥料，甚至是丢弃，很是可惜。植物中的内酯类物质，多有驱虫、抗凝血、抗癌及抗菌作用[2]，芳樟树叶含有大量具有抗癌活性的内酯类物质。本研究主要是考虑从芳樟叶渣中提取具有抗癌活性的内酯类物质，从而提高纯种芳樟的综合利用价值，开拓芳樟资源的应用领域。
目前，在植物有效成分提取中，已大量采用微波、超声波辅助提取等新技术，以克服有机溶剂冷浸法和索氏提取法等传统提取工艺提取时间长,溶剂消耗多,且生产效率低的缺点[3-5] 。本研究主要利用超声波产生的强烈振动、空化、粉碎、搅拌等特性[6,7]，结合正交试验对芳樟树叶总内酯进行超声辅助提取，优选超声提取工艺条件，同时确立以碱性水解法测定芳樟树叶总内酯的定量方法,以期找出合理可行的芳樟树叶总内酯的提取工艺。经检索，国内外文献中尚未有从芳樟树叶中提取出芳樟总内酯的相关报导。
1 材料与仪器
1.1 材料 纯种芳樟树叶(供试药材系福建省厦门市牡丹香化有限公司牡丹一号纯种芳樟人工培植基地提供的提取精油后的芳樟树叶) ；其余试剂均为分析纯。
1.2 仪器 KQ-500B超声波发生器(昆山市超声仪器有限公司)；旋转蒸发仪(日本日立U - 200型)；DZF型真空干燥箱(上海精密实验设备有限公司)；低速离心机（上海安亭科学仪器厂）。
2 实验方法
2.1 芳樟树叶预处理：芳樟树叶在60℃条件下干燥60min，粉碎，过20目筛，备用。
2.2 正交表的设计
2.2.1 选表 根据预实验结果，选择提取次数(A) 、提取时间(B)、乙醇浓度(C)和乙醇用量(D)4个因素,每个因素3个水平进行优选，故选用L9(34)正交表。
2.2.2 因素水平表
Table 1 Factor - level of orthogonal design
|
levels
|
A/times B/ min C/% D/times
|
|
1
2
3
|
1
2
3
|
30
60
90
|
70
80
90
|
4
5
6
|
2.3 内酯定量方法
因芳樟抗癌有效成分为内酯类化合物，由于其结构上有一内酯结构，故可以将其水解，已知过量的碱性条件能保证内酯完全水解，过多的碱可用标准的盐酸溶液回滴，从而可计算出芳樟总内酯的量。
2.4 内酯含量测定
精密吸取提取液10ml于100ml三角瓶中，加蒸馏水10ml，酚酞指示剂2滴，用0.1N氢氧化钠标准溶液校正至刚出现红色为止。再精密加入0.1N氢氧化钠标准溶液5ml，在80-90℃水浴上水解15min，冷却到室温，用0.1N盐酸标准溶液回滴至淡黄色，按下述公式计算内酯含量。计算公式如下： 
 总内酯含量％＝ 
2.5 提取方法
2.5.1 超声波法：精密称取药材粉末10g,按表1编号所指实验条件进行超声提取,即将芳樟树叶粉末在加乙醇充分润湿后，按表1编号所指实验条件，于超声波中震荡提取,超声提取仪的工作频率40KHz ,输出功率为500W。收集提取液,过滤, 离心20min，收集上清液，加2g活性炭，于70℃水浴中保温脱色15min。过滤，滤液减压浓缩至一定体积,以90%乙醇定容至100ml,即为供试液。根据以上内酯测定方法计算芳樟总内酯含量。
2.5.2 冷浸法：称取药材粉末10 g，用90％乙醇60ml在室温下浸泡过夜，滤出提取液，残渣再加60ml乙醇，同样条件下冷浸，过滤。合并滤液，加2g活性炭，于70℃水浴中保温脱色15min。过滤，滤液减压浓缩至一定体积,以90%乙醇定容至100ml,即为供试液。根据以上内酯测定方法计算芳樟总内酯含量。
2.5.3 索氏提取法：称取药材粉末10g于滤纸筒中，用90％乙醇约10ml充分润湿，于250ml烧瓶中加90％乙醇50ml于80-90℃水浴中回流120min，滤出提取液，离心20min，收集上清液，加2g活性炭，于70℃水浴中保温脱色15min。过滤，滤液减压浓缩至一定体积,以90%乙醇定容至100ml,即为供试液。根据以上内酯测定方法计算芳樟总内酯含量。
3 结果与讨论
3.1 正交实验结果 正交实验结果及极差分析结果见表2。
Table 2 L9( 34) arrangement and results of orthogonal test
|
No.
|
Frequence
|
Time
|
Concentration
|
Multiple
|
Results
|
|
A
|
B
|
C
|
D
|
Total lactones/%
|
|
1
2
3
4
5
6
7
8
9
|
1
1
1
2
2
2
3
3
3
|
1
2
3
1
2
3
1
2
3
|
1
2
3
2
3
1
3
1
2
|
1
2
3
3
1
2
2
3
1
|
1.217
2.661
3.022
2.285
1.910
2.281
2.305
2.645
1.811
|
|
K1
K2
K3
|
6.900
6.476
6.761
|
5.807
7.216
7.114
|
6.143
6.757
7.237
|
4.938
7.247
7.952
|
|
|
k1
k2
k3
|
2.300
2.159
2.254
|
1.936
2.405
2.371
|
2.048
2.252
2.412
|
1.646
2.416
2.651
|
|
R
|
0.141
|
0.469
|
0.364
|
1.005
|
从表2 极差分析可以看出,最佳工艺条件为A1B2C4D4 。而对提取效率影响最小者为A项,即提取次数的增加，对提取内酯的影响很小，把A项作为空列,作为误差处理,进行方差分析,结果见表3。
Table 3 Analysis of variance
|
Source
|
SS
|
DF
|
MS
|
F
|
P
|
|
A
|
0.031
|
2
|
0.016
|
1.000
|
——
|
|
B
|
0.412
|
2
|
0.206
|
12.875
|
P<0.1
|
|
C
|
0.200
|
2
|
0.100
|
6.250
|
P>0.1
|
|
D
|
1.657
|
2
|
0.829
|
51.813
|
P<0.05
|
F0.1(2,2)=9 F0.05(2,2)=19
由表2和表3可知,乙醇用量和提取时间对芳樟总内酯提取效率有显著性影响。最佳提取工艺为A1B2C4D4,即用药材6倍量的90%乙醇超声提取1次,每次60 min。影响提取的主次因素为D > B > C > A ,即乙醇用量> 提取时间> 乙醇浓度> 提取次数。
3.2 验证实验 根据正交试验得到的最佳工艺条件超声提取3批芳樟干树叶，得到芳樟总内酯，并测定含量。3批样品总内酯含量的平均值为3.209％。
3.3 不同提取法效果比较 不同提取法所得到的实验结果如表4所示，超声法得到的总内酯含量最高，索氏法次之，冷浸法的效果最差。索氏法虽然也省时，但药材受热时间长，会影响到芳樟内酯的生物活性。
Table 4 Comparison of different extraction technologies
|
Extraction methods
|
Total lactones/％
|
|
Ultrasonic extraction
|
3.209
|
|
Solvent extraction
|
1.258
|
|
Soxhlet extraction
|
2.041
|
4 结论
超声法比索氏法和冷浸法能更好地提取芳樟总内酯。乙醇用量和提取时间对超声提取效率影响显著。最佳超声提取工艺为：在超声条件下，用药材6倍量的90%乙醇提取1次,每次60 min，提取所得芳樟总内酯的含量为3.209％。本实验最终得到的超声提取工艺，不仅适用于工业化生产，又为进一步提取分离有抗癌活性的二苄基丁内酯类化合物奠定了基础。
|